Как и в предыдущих играх серии главный герой — водопроводчик Марио. Злодей король Купа похищает принцессу Тоадстул и заточает динозавра Ёси в яйцо. Марио освобождает Ёси и верхом на нём отправляется к замку короля Купы спасать принцессу. Врагами на пути являются черепахи, броненосцы и другие животные.

Геймплей не претерпел особых изменений, главным нововведением стала возможность использовать Ёси в качестве средства передвижения и его боевые способности (например, поедание противников). В игре присутствует большое количество скрытых секретов, таких как сокращения пути, бонусные уровни и т. д. Всего в игре 74 игровых зоны и 96 выходов из них (игра переняла приём у предыдущей Super Mario Bros. 3 и игровой уровень возможно пройти несколькими способами).