Цель игры — уничтожить паразитов. Марио и Луиджи могут двигаться влево и вправо, а также прыгать. Главный способ атаковать врагов — подпрыгивать, ударяя снизу головой платформу, по которой в этот момент движется противник. После такой атаки враг переворачивается на спину и на некоторое время остаётся без движения. Нужно успеть добраться до него и выпнуть с уровня, пока противник не успел перевернуться и встать на ноги. Если удаётся успеть это сделать, противник окончательно выходит из строя, падает за нижний край экрана и, судя по появляющемуся фонтанчику синих брызг, тонет в воде. Если нет — враг ускоряется. Если игрок повторно подбивает врага и снова не успевает пнуть его, враг ещё раз ускоряется, но это будет уже предельная для него скорость.

Время от времени из трубы появляется монета, поймав которую игрок получает дополнительные очки. При наборе достаточного количества очков игроку даётся дополнительная «жизнь».

Также игрок может использовать «POW» (сокращ. «POWER» — мощность) — блок в центре игрового поля, от удара по которому все присутствующие на уровне враги переворачиваются, как от удара (в том случае, если противник в этот момент уже «оглушён» ударом, он возвращается в «активное» состояние). «POW» можно использовать только трижды за прохождение одного уровня, с переходом на следующую зону ресурс восстанавливается.

Примерно каждые 5 уровней игрокам предлагается сыграть в бонусную игру — на этом уровне нет врагов, а есть лишь монеты, которые нужно собрать за ограниченное время. Если игроку удаётся собрать все монеты, то помимо их стоимости он получает дополнительные очки, если нет — только стоимость собранных монет.