Главными героями игры являются водопроводчик Марио и его брат Луиджи (в качестве игрового персонажа для второго игрока). Цель игры — пройти через Грибное королевство, ускользая или уничтожая солдат черепашьего Короля Купы (также известного как Боузер), чтобы спасти захваченную им в плен Принцессу.

Марио (или Луиджи) атакует противников, прыгая на них сверху (такой способ убивает грибы Гумба и временно нейтрализует черепах Купа, заставляя их прятаться в свои панцири) или ударяя по платформе, на которой находится противник, снизу. «Испугавшихся» черепах можно использовать как оружие против других врагов, подтолкнув панцирь впереди себя: разогнавшись, он сметает всех на своем пути, но когда встречает преграду, меняет направление и может ударить самого Марио. На некоторых врагов, например дикобразов Спини, нельзя запрыгивать, так как это ранит Марио. Их можно убить, выстрелив огненным шаром, пнув в них черепаху или ударом по платформе снизу. То же самое касается хищных растений, регулярно показывающихся из торчащих в земле труб. Некоторые из этих труб являются проходом в бонусный уровень, подземелье, в котором можно найти небольшое количество монет, а заодно сократить путь до выхода с уровня. Также встречаются ростки, по которым Марио поднимается на облака, бонусный уровень, на котором большое количество монет и нет противников.

По пути Марио собирает монеты и бонусы, ударяя по блокам со знаком вопроса, а также выискивая секретные хранилища монет в кирпичных стенах. При наборе ста монет Марио получает дополнительную жизнь. За поверженных врагов начисляются очки, которые не приносят какой-либо практической пользы, а служат лишь для отражения мастерства игрока. При наборе 1 миллиона очков шестизначное табло увеличивается до семизначного. При последовательном поражении врагов одним черепашьим панцирем очки начисляются по возрастающей за каждого убитого: 500, 800, 1000, 2000, 4000, 5000, 8000 очков, а затем (при поражении восьмого персонажа) Марио начисляется дополнительная жизнь.

Среди бонусов может встретиться оранжевый гриб, взяв который, персонаж увеличивается в размерах, превращаясь в Супер Марио (англ. Super Mario). Если взять после этого цветок, то Супер Марио становится Огненным Марио (англ. Fire Mario) и получает возможность стрелять огненными шарами, то есть поражать противника на расстоянии.

Если Супер Марио или Огненный Марио дотрагиваются до противника, то они возвращаются в стадию Марио. Если же противник ранит Марио или кончается время, выделенное для прохождения уровня, то игрок теряет одну жизнь и игра начинается заново (либо с начала уровня, либо с его середины). В уровнях, которые расположены в за́мках, погибший Марио начинает игру всегда с начала уровня.

Ещё один встречающийся в игре бонус — звезда. Она не «вырастает» из блока как гриб, а выскакивает из него и начинает перемещаться по синусоидальной траектории вперёд по направлению движения. Заполучив её, Марио становится на некоторое время неуязвимым для врагов: противники погибают от одного его прикосновения. На некоторых уровнях встречаются также бонусы в виде зелёного гриба «1-up», который добавляет Марио одну жизнь (гриб «1-up» движется, и для того, чтобы его поймать, игроку приходится проявить сноровку).